桂枝茯苓胶囊在健康志愿者身上的进行药代动

From:nature,16August

桂枝茯苓胶囊（GZFL），一种中药制剂，被广泛的用于缓解痛经，如今在美国进入到二期临床实验。由于GZFL中含有五种低曝光的成分（苦杏仁素、肉桂酸、没食子酸、芍药苷、丹皮酚），一种定性和定量的确认GZFL代谢产物和描述GZFL药物代谢动力学性质的方法应运而生。在此方法中，LC-Q-TOF/MS用来确认和在结构上阐明GZFL在体内可能的代谢产物，同时基于时间的代谢物确定法（TBMCs）也被用来确认未知代谢物。

这种有LC-MS/MS产生的实时定量结果显示出五种有效成分的低曝光情况。根据我们所建立的方法，我们总共发现和阐明了有36个代谢产物和结构。利用LC-MS/MS进行的实时半定量分析显示具有明显的时间-浓度曲线可用来确定12种代谢物，其中大多数可显示更高的曝光率。本研究提供一个关于人类GZFL代谢过程更容易理解的思路。

痛经初期（PrD）在月经期经常发生并伴随腹部的疼痛、持续性疼痛、眩晕、胃肠道不适。流行病学调查方法显示13.5%的中国女性遭受PrD并影响了正常的工作和生活质量。中药在(TCMs)因其多靶点作用机制、显著的治疗效果和温和的副作用在治疗PrD方面有一定优势。桂枝茯苓胶囊（GZFL）在中国是一种被广泛用于治疗PrD的中药，显示出明显的临床效果。GZFL的处方是将桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、白芍及其根等比例混合，发挥多重作用，比如改善血液循环、血液状态和平衡机体紊乱。常被用来治疗慢性骨盆炎（CPID）,子宫肌瘤，PrD，子宫内膜异位（EMs）和数种其他类型的阻塞综合征。GZFL已经完成了在美国的二期临床实验（NCT）。

关于TCMs的分析被认作“复杂系统研究”由于不同种类化合物复杂的物理化学性质，有可能会干扰化合物的分析。GZFL中低浓度和主要有效成分的曝光（没食子酸（GA）、肉桂酸（CA）、芍药苷（PAE）、苦杏仁素（AMY）、和丹皮酚（PA））同样会使GZFL在体外的研究困难重重。因此，GZFL有效成分的的代谢产物对其进行药代动力学分析要好于对药效成分的分析。这些药效成分的结构在表1中显示。

近年来，有很多的分析仪器，比如毛细管电泳（CE）、气象色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）结合质谱（MS），常被用来分析TCMs的复杂化合物。在这些设备中，最吸引人和最有前景的工具有高选择性和灵敏性的LC-MS。基于这一技术，本方法用来研究GZFL的体外实验。该方法包含下列步骤：1.数据的获取2.代谢物的确定3.代谢产物结构的阐释4.体内半定量5.体内代谢物药代动力学分析。

因此，为了描述GZFL在体内的过程并阐明GZFL的治疗效果，对药物有效成分的药代动力学进行了研究分析，并阐明口服吸收后在人体血浆内GZFL的代谢物。这些结果有利于更好的理解人体中GZFL在体内的曝光以此来为未来药学的发展和临床的应用提供理论支持。

结论

人体血浆中GZFL的有效成分的药代动力学分析：在给十名志愿者口服给药2-3粒GZFL胶囊（内容物：AMY5.66mg/胶囊，CA0.23mg/胶囊，GA2.2mg/胶囊，PAE6,99mg/胶囊，PA4.79mg/胶囊）后，用LC-MS/MS在不同的时间点检测患者体内AMY,CA,GA,PAE和PA的浓度。口服后CA的浓度很高，GA和PAE含量较低，AMY和PA在体内几乎检测不到。药代动力学研究结果显示体内药物浓度随着给药剂量的增加而增加。药物的Tmax大约持续1-3小时，t1/2大约持续0.9-4.34h。CA和GA的药代动力学参数在表一中显示（AMY和PA的药代动力学参数没有显示因为他们无法估算）。离子和检测参数在表二中显示。

一种推荐使用的，用来描述体内GZFL药代动力学性质的方法。这种方法用来确鉴别，定性和定量的研究GZFL在人体内的代谢产物其整体的药代动力学性质。这种体内研究GZFL的方法包括以下步骤：1、通过LC-Q-TOF/MS手段在多个不同时间点对全局数据进行收集。2.通过软件对质量峰进行采集，例如使用MetabolitePilot1.5和PeakView来分析样品数据以确定可能的代谢产物。3.代谢产物的化学结构通过靶向质量碎片进行阐明。4.通过LC-MS/MS的MRM模式对代谢产物进行半定量方法和PK曲线研究。5.通过代谢物来对GZFL在体内的新城代谢过程进行研究。

体内代谢峰的采集。该数据来自LC-Q-TOF/MS，其中用合适的方法得到检测物中包含着的全部的质量信息，比如沉淀物。为了从沉淀物中得到有用的信息，吸收峰观测软件被应用于代谢物的发现之中。在这款软件中，药物吸收后的样本和空白样本直接比较，用来找出两个样本的所包含的物质，通常有成百上千个之多。之后，通过设定样品和对照的比率为10缩窄目标峰筛选数据，使其少于一百个便于得到可能所需的代谢物。该步骤包括下列因素：1.保留时间。2.质量亏损的改变。3.确定样品和空白对照组中的化合物。4.百万分之一的错误（ppm）

代谢物结构的阐明：MetabolitePilot1.5软件使用多因素数据进程算法：普通峰的寻找，多种质量检测波长，同位素模式匹配，基于常见的丢失的离子或中性粒子来寻找代谢物。使用本软件自动比较药物吸收后的样品和空白对照样品，以寻找可能的代谢物和代谢通路。代谢物的相关信息，例如名称、公式、质核比、ppm，R.T和峰面积将会在本软件中显示。MetabolitePilot1.5软件同样可以给出MS/MS碎片用以阐明代谢物结构而对药物不同部位的质量进行计算。

基于时间的代谢物确认步骤（TBMCs）：这个步骤基于著名的药代动力学实验“每种进入到体内的分子都遵循ADME过程”。如果在药物吸收后观测到的一个未知峰显示出容易辨认的PK曲线，他可能是有药物相关。因此，在药代动力学性质研究中，母核离子和未知代谢物的产物离子将会由LC-MS/MS的检测器所检测出。以上所有的方法在图2中显示。

人体血浆中GZFL代谢物的识别和鉴定：人体血浆中GZFL的代谢物的识别和鉴定对于描述人体GZFL中PK曲线的性质至关重要。在人体血浆中，LC-Q-TOF/MS被用来确认生物代谢产物。由于GZFL的复杂性，代谢物的识别和鉴定非常困难，使用以上我们所建立的方法，一共确定了36中潜在的不同代谢产物，显示在表3中。AMY,CA,GA,PA,和PAE代谢成3,2,7,15,代谢物。人体血浆中代谢物M31到M36的发现基于TBMCs。

人体血浆中GZFL代谢物的结构说明：在本部分，根据视图峰值的计算、MetabolitePilot1.5软件、思考和MS/MS碎片，可推演出一些结构和信号通路。这种特殊的结构和代谢通路在图3中显示。

LC-MS/MS对代谢产物的半定量分析结果：通过TOF/MS得到的各种代谢物的分子离子为Q1,从由LC-Q-TOF/MS发现的从各种代谢物的产物离子得到的大量离子为Q3，通过比较不同的偏移发现DP值和CE值最佳。这些检测器选用的离子和参数在表2中显示。12种代谢物的时间相关曲线在图4中列出。基于这些曲线，GZCL在人体血浆中的代谢产物被半定量化后用于推断GZFL在体内的进程。服用2/3粒胶囊后在代谢物的分布中存在着非常明显的剂量关系。

讨论

当研究TCMs的药代动力学性质时，存在两种挑战。一种是建立一种同时从不同种类的TCMs对复杂成分进行简单快速的检测的方法；另一种是难以通过低暴露的药物成分来表征中药的药代动力学过程，该过程可能会导致药物成分的浓度较低或者口服生物利用度较低。在本实验中，LC-MS/MS的方法用于同时对五种常见的药物有效成分进行定量分析（AMY,CA,GA,PA和PAE），这些物质是桂枝茯苓胶囊（桂枝、茯苓、桃仁、山茱萸皮和白芍）的代表组分，并新发现了12种代谢物。特异性，回收率，基质效应，精确度，精密度，线性关系和该方法的稳定性均被验证（数据将被发布）。PAE的回收率RSD是2.7%-10.6%，CA和PAE的基质效应的RSD是6.3-13.4%和1.7-10.4%。在人体血浆中，GA的稳定性室温在24h后显示不稳定（9.3-36.7%）GA的稳定性在室温下6h得到了进一步的验证，结果显示，人体血浆中的GA在室温下保持6h显示稳定（93.1-%）。结果显示，在从临床上取得血浆样本后，所有的样本应该保留在-70摄氏度或者在六个小时内将其分离一保持GA的稳定性。

在人体血浆中只有CA，GA和PAE能被检测到，而AMY和PA因其低曝光率则无法被检测出来。CA的Cmax超过ng/ml，但CA的药代动力学活性报告用于解决抗癌抗菌素的活性，低血糖活性、降血脂活性和抗微生物-抗炎活性，并不包括缓解痛经。GA和PAE有舒张肌肉和缓解疼痛的作用。但是其Cmax值均低于10ng/ml。因此，GZFL的活性有可能不是因为其药效成分所致而是其代谢产物。

我们进一步建立一种对GZFL在人体血浆中代谢物鉴别、定性、定量的研究方法。在本方法中，LC-Q-TOF/MS高分辨率质谱光谱仪用来确认GZFL在人体血浆中的代谢产物。使用软件和我们的方法，总共有36种潜在的代谢物被发现。对代谢物定性和定量的研究基于血浆样本中的色谱峰和浓度-结构时间曲线。在MetabolitePilot1.5软件和从父类药物与代谢物产物离子分析的帮助下对其结构进行阐明。PA是第15个被发现的代谢物，其碎片离子的质核比为.08，推测有去甲基碎片，检测为M1，M4，M5，M9，M13和M14。去加万古霉素在和葡萄糖醛酸结合后的代谢物显示的碎片离子的质核比是.07，并可进一步形成二聚体显示质核比.15。硫酸和谷胱甘肽的结合同样被检测出来，PAE可被代谢成三种代谢物，其糖苷结构容易水解成糖基和苷元。对羟基化的代谢物也可被检测到。AMY代谢成三个代谢产物，AMY的糖苷键水解成代谢物的形式。GA代谢成七个代谢物。GA和葡萄糖醛酸、硫酸、带有酚羟基的谷胱甘肽结合同样被检测出来，CA代谢成两种代谢物，对羟基化的代谢产物和与葡萄糖醛酸分别结合。根据前一种碎片进行推测，大部分在人体血浆内的的生物转化形式的代谢物是从源于PA、PAE、AMY、GA和CA与葡萄糖醛酸和硫酸的结合产物。36种代谢物中有六种潜在的代谢物无法与其母核药物相匹配。

通过LC-Q-TOF/MS，高分辨率质谱和LC-MS/MS质量检测器进行定量检测的优势在于使用半定量分析的手段对人体内36种代谢物中数种典型代谢物进行研究。共有12中代谢物显示出显著的时间-血浆浓度曲线，如图4.以上结果为我们从LC-Q-TOF/MS高分辨率质谱中获取代谢物的存在证据。而且，从峰表中发现的人体血浆中的一些物质显示出显著的时间-浓度相关性。尽管这些物质的结构和信息无法确定，但我么也可以将其假定为代谢物。

人类血浆中代谢物的浓度无法定量检测的原因在于缺乏正规的标准。三种PA-葡糖醛酸代谢物显示给予峰面积的最高强度。由于缺乏在老鼠血浆中的PA的活性标准，在合成及分离这三种PA-葡糖醛酸代谢物之后进行更多的药代动力学分析来推测这三种PA-葡糖醛酸代谢物是有效成分。

在表三中总结了用我们的方法所确认的化合物，用LC-Q-TOF/MS定性检测并用LC-MS/MS进行定量检测通过对已有的方法进行比较，这种检测方法因其准确度高，操作简单更适合来确认TCMsd的代谢物。一些存在于TCMs中的痕量代谢产物可通过该方法进行确定。更多的证明实验应该用以确认矫正代谢物的化学结构。

TCMs的药理学机制的阐明迄今为止依旧颇具挑战性。因此，为了明确GZFL的药理学机制，代谢物的确认，定性和定量分析至关重要。确认活性化合物或者特定的代谢通路可能更容易理解在体内GZFL代谢过程其作用机制的探索和为假设提供理论基础。

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